08/04/2008 18h34
Uma técnica desenvolvida na Fiocruz Pernambuco pode tornar a identificação do parasita causador da esquistossomose, o Schistosoma mansoni, mais rápida e precisa em caramujos encontrados em focos da doença. É a PCR quantitativa em tempo real (qPCR), uma ferramenta molecular com eficiência de 99%, que pode ser usada como alternativa e/ou complemento à técnica de exposição à luz. Esta, considerada, hoje, padrão-ouro para verificar a contaminação dos vetores da barriga d’água, como a doença é popularmente conhecida, exige mais tempo, custo e mão-de-obra para a obtenção de resultados.
A qPCR, do inglês quantitative polimerase chain reaction (reação em cadeia de polimerase quantitativa), permite que a leitura da análise dos caramujos, hospedeiros intermediários do parasita que contamina o homem, seja feita enquanto é processada, a cada segundo, no computador. Para a realização desse processo, não é preciso que os caramujos estejam vivos. Eles são analisados em lotes de 50 amostras maceradas conjuntamente.
Na técnica convencional, os caramujos coletados são expostos, um a um, à luz, em recipientes com água, para que sejam analisados, no microscópio, se eles eliminam ou não as larvas infectantes (cercárias), responsáveis pela infecção dos seres humanos. A coleta ocorre em áreas de manifestação da doença e precisa ser feita várias vezes e em grande quantidade, porque os caramujos coletados morrem antes de chegar ao laboratório ou estão no período de incubação da cercária. Essa fase dura, em média, de 30 a 40 dias. “Esses problemas que ocorrem no uso da técnica convencional impedem a tomada de decisão sobre as ações de contenção da transmissão quando sabemos que há várias pessoas doentes na comunidade”, explica Constança Simões Barbosa, pesquisadora do Departamento de Parasitologia e chefe do Serviço de Referência em Esquistossomose da Fiocruz Pernambuco.
Outra vantagem da PCR quantitativa em tempo real é que ela é capaz de estabelecer o quanto o caramujo está infectado, em termos percentuais. “Antes dizíamos se o resultado era positivo ou negativo para a presença do Schistossoma. Com a qPCR, podemos quantificá-lo, determinando o índice de infectividade de cada foco examinado. Assim, é possível saber se aquela região tem maior ou menor risco de transmitir a doença para os humanos”, afirma a biomédica Ana Lisa do Vale Gomes, que desenvolveu a técnica para identificação do parasita e a otimizou para uso em lotes de caramujos como trabalho de conclusão do mestrado em saúde pública da Fiocruz Pernambuco. O estudo foi orientado por Constança Simões Barbosa e por Carlos Eduardo Calzavara, do Departamento de Virologia e Terapia Experimental (Lavite).
Superioridade
É a identificação da infectividade do caramujo, o fator que torna essa ferramenta mais eficiente do que a técnica de exposição à luz e que os outros tipos de PCR estudados no CPqAM, os quais também podem ser utilizados com o objetivo de identificar focos da esquistossomose. Os quatro tipos - PCR simples, Nested PCR convencional e Nested PCR em um único tubo – também foram comparados por Ana Lisa.
De acordo com ela, todas as PCRs identificam o Schistosoma mansoni com mais sensibilidade, rapidez e eficiência que a técnica convencional. Porém, cada uma apresenta sensibilidade diferente. “Entre a PCR simples e a PCR em tempo real há uma diferença de sensibilidade de mil vezes. Apesar disso, a forma simples é muito mais sensível que o método convencional”, explica a biomédica. Em relação à especificidade, a Nested PCR, a PCR em único tubo e a qPCR são de 85% a 93% superiores à técnica convencional.
O que diferencia a qPCR das outras três PCRs é o fato de gerar resultado instantâneo e exato. Para obter o resultado, que se dá em tempo real, como foi denominada a técnica, é desnecessário esperar a reação acabar, para, em seguida, fazer a leitura do resultado. “Isso diminui o risco de contaminação cruzada, na qual as amostras negativas são identificadas como positivas, gerando resultados falso-positivos”, ressaltou Ana Lisa. Esse é outro ponto que torna a técnica superior as demais.
Diante dos resultados, as técnicas de PCR serão introduzidas à rotina do Serviço de Referência em Esquistossomose. “A PCR é uma solução da biologia molecular para a epidemiologia. Ganhamos em tempo e em custos. Pela técnica de exposição à luz, o processo entre coleta e detecção pode levar meses”, destaca Constança Barbosa, chefe do serviço.
Saiba mais sobre a técnica de PCR
PCR simples: é uma reação enzimática, onde um fragmento de DNA (alvo molecular) pode ser amplificado milhares de vezes, desde que pelo menos uma das extremidades do alvo sejam conhecidas.
Nested PCR convencional: são duas reações de PCR consecutivas, onde o resultado da primeira reação serve de alvo para a segunda reação, garantindo, assim, maior sensibilidade e especificidade do resultado pretendido.
Nested PCR em único tubo: é uma Nested PCR onde as duas reações ocorrem em um único tubo e não mais em dois. Os iniciadores para a segunda reação ficam imobilizados a 37°C, na face interna da tampa do tubo, diminuindo os riscos de contaminação cruzada do material genético.
PCR quantitativa em tempo real: abordagem mais recente das PCRs que permite a leitura do resultado no momento em que a reação está acontecendo, diminuindo os riscos de contaminação.
* A ilustração na chamada principal faz referência ao parasita Schistosoma mansoni, causador da doença.
Fonte: Agência Fiocruz de Notícias
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